Zrýchlená izolácia

Zrýchlená izolácia DNA vzoriek

Zrýchlená metóda izolácie DNA z biologických vzoriek, založená na použití zmesi iónovýmenníkov pre odstránenie solí z prostredia a proteolytického komplexu, pre inaktiváciu nukleáz a ostatných inhibítorov. Izolovaná DNA je použiteľná pre PCR bez dodatočného čistenia. Zrýchlená príprava sa odporúča pre diagnostiku bakteriálnych infekcií a pre diagnostiku vírusových infekcií, obzvlášť herpes vírusov, papilloma vírusov a iných, v steroch z genitálnej sliznice.

Zrýchlená izolácia vzoriek sa doporučuje v prípade vzoriek s malým obsahom biologického materiálu (slina, moč, slza, stery z nosohltanu, slizníc atď.). Pre odber vzorky steru zo sliznice,výter alebo výplach slizice sa používa sterilný fyziologický roztok s objemom 0,5 až 1 ml a jednorázové špeciálne stierky alebo sondy. Plazma, krvné sérum, spinomozgová tekutina a moč môžu byť použité bez rozriedenia vo fyziologickom roztoku. Moč pre analýzu musí byť číry, bez soľnej usadeniny. V prípade zakalenia moču sa doporučuje moč zohriať v termostate 15 – 20 minút pri teplote 37 °C.

Poznámky:

• Všetky vzorky pripravené na úpravu musia byť bez slizničného sekrétu alebo hlienu.
• Pri úprave vzoriek, ktoré obsahujú veľa slizničného sekrétu alebo hlienu, doporučuje sa použiť špeciálne mukolytické a neutralizujúce reagencie (MucuLysis reagent).
• V prípade prítomnosti veľkého množstva biologického materiálu (stery zo sliznice atď.) je nevyhnutné odobrať zvrchu 100 – 500 ml nad úsadeninou, preniesť do čistej mikroskúmavky a použiť v zrýchlenej príprave vzoriek.

1. Príprava pracovného EnzyMixu^TM. Do mikroskúmavky s EnzyMix^TM pridať celý objem (100 ml) rozpúšťadla EnzyMix^TM a premiešať do úplného rozpustenia suchého obsahu. Energicky pretrepávať aby sa zmylo aj zo stien mikroskúmavky. Úplné rozpustenie trvá do 15 minút. Hotový EnzyMix^TM skladovať pri (–20 °C) počas 1 roku.
2. Príprava pracovného ExtraGene^TM. Do mikroskúmavky s 1 ml ExtraGene^TM dodať 10 ml pracovného EnzyMix^TM. Premiešať a uložiť do chladničky k ďalšiemu použitiu. Hotový pracovný ExtraGene^TM možno skladovať pri (2 až 8 °C) počas 1 týždňa. Podľa potreby, možno analogickým postupom pripraviť pracovný ExtraGene^TM požadovaného objemu, pri dodržaní objemových pomerov jednotlivých komponentov.
3. Centrifugovať analyzované vzorky (suspenziu biologického materiálu vo fyziologickom roztoku do 1,0 ml) 2 minúty pri 10 000 ot./min pre zber bunkového materiálu.
4. Opatrne bez rozvírenia sotva pozorovateľného sedimentu odstrániť supernatant s pomocou vodnej vývevy.
5. K sedimentu pridať 50 až 200 ml hotového pracovného ExtraGene^TM, v závislosti od objemu získaného sedimentu a na vortexe suspendovať až do rozbitia sedimentu. Pozor! ExtraGene^TM treba odoberať z celkového množstva za stáleho miešania! (2. a 5.).
6. Inkubovať mikroskúmavky pri 56 °C, 30 min. a potom pri 100 °C,10 min.
7. Centrifugovať mikroskúmavky 10 až 15 sekúnd pri 10 000 ot/min pre zber zrazenín a usadenín nerozpustného odpadu. Pre reakciu použiť 10 ml priezračného supernatantu bez čiastočiek ExtraGenu.

Prítomnosť nerozpustených častíc ExtraGenu v reakčnej skúmavke vedie k úplnej inhibícii reakcie, ktorá dáva falošné negatívne výsledky