Univerzálna izolácia

Jednoduchá a efektívna metóda izolácie DNA z biologických vzoriek, založená na väzbe DNA s auxotrofným činidlom lokalizovaným na povrchu sklenených guličiek. Izolovaná DNA je použiteľná pre PCR bez dodatočného čistenia.

1. Príprava pracovného roztoku Soľného pufru. Obsah flakónu so soľným pufrom 10 ml dať do odmerného valca. Doplniť redestilovanou vodou do 100 ml a doplniť 96% etanolom do objemu 300 ml a premiešať. Takto získaný roztok sa môže skladovať v hermeticky uzatvorenej nádobe pri teplote (2 až 8 °C ) 1 rok.
2. Do mikroskúmavky objemu 1,5 ml dať 100 ml analyzovanej vzorky (krv, plazma, krvné sérum, sliznicový ster vo fyziologickom roztoku, moč alebo inej analyzovanej tekutiny) pridať 300 ml lyzačnej reagencie a premiešať otáčaním – prevracaním mikroskúmavky.
3. Inkubovať mikroskúmavku 5 min. pri 65 °C. V prípade prítomnosti nerozpusteného sedimentu v skúmavke, mikroskúmavku centrifugovať 5 až 10 s pri 5000 ot./ min., supernatant preniesť do čistej mikroskúmavky a sediment vyhodiť.
4. Do mikroskúmavky pridať 20 ml suspenzie sorbentu NucleosTM (pred použitím NucleosTM treba intenzívne pretrepať na vortexe do úplného homogénneho stavu).
5. Mikroskúmavku premiešať na vortexe alebo ručne 5 min., centrifugovať 10 sekúnd pri 5 000 ot/min. a odstrániť supernatant. Ak sa DNA získava z krvi alebo homogenátov tkanív s vysokým obsahom hemoglobínu, sediment sorbentu po centrifugovaní a odstránení supernatantu treba premyť ešte 200 ml Lyzačnej reagencie. Ďalej postupovať podľa protokolu.
6. Do mikroskúmavky pridať 1 ml Soľného pufru (pozri bod 2.) a intenzívne premiešať.
7. Centrifugovať 10 sekúnd pri 5000 ot./min.
8. Opatrne odstrániť supernatant bez dotyku sedimentu s pomocou vodnej vývevy.
9. K sedimentu pridať 1 ml Soľného pufru, dôkladne premiešať na vortexe 5 až 10 sekúnd do úplného homogénneho stavu. Poznámka: Ak nastane pevné zhlukovanie sorbentu, treba ho mechanicky rozbiť opatrným premiešaním špičkou pipety a až potom intenzívne premiešať na vortexe.
10. Mikroskúmavku centrifugovať 10 sekúnd pri 10 000 ot./min.
11. Odstrániť supernatant nedotýkajúc sa sedimentu s pomocou vodnej vývevy.
12. Opakovať postup 9. až 11.
13. Sediment sušiť 3-5 minút pri 65 °C. Sušiť je treba pri otvorených skúmavkách.
14. Do mikroskúmavky pridať 100 ml východiskového ExtraGeneTM. Pozor! ExtraGeneTM treba odobrať z celkového objemu pri nepretržitom premiešavaní.
15. Obsah mikroskúmavky premiešavať na vortexe 5 až 10 sekúnd do homogénneho stavu, potom inkubovať 5 minút pri 65 °C. Obsah mikroskúmavky ešte raz premiešať na vortexe pred centrifugovaním.
16. Mikroskúmavku centrifugovať 1 minútu pri 10 000 ot./min. Čistý supernatant s DNA (bez čiastočiek ExtraGeneTM a NucleosTM) preniesť do čistej mikroskúmavky pre skladovanie alebo použiť pre izoláciu DNA PCR. Prítomnosť granúl ExtraGenu v reakčnej skúmavke vedie k úplnej inhibícii reakcie, ktorá dáva falošné negatívne výsledky. Skladovať pri teplote (–20 °C ).