Realbest extrakcia 1000

Sada reagencií „RealBest extrakcia 1000“ je určená na izoláciu nukleových kyselín z krvnej plazmy a krvného séra. Sada reagencií „RealBest extrakcia 1000“ je možné používať v klinickej praxi pri diagnostike rôznych infekcií.

1. Pred začatím práce je potrebné vybrať sadu reagencii z chladničky, otvoriť obal a nechať spolu s analyzovanými vzorkami pri izbovej teplote 18-25°C asi 30 min.
2. Vybrať zo sady pre PCR „RealBest“ flakón s PKV, ktorá zodpovedá danej PCR sade.
3. Do flakónu s vnútornou kontrolnou vzorkou (VKV) pridať 1 ml roztoku pre obnovu kontrolných vzoriek (RKO) a dobre premiešať. Nechať pri izbovej teplote 15 min. a opäť dobre premiešať.
4. NKV je pripravená k použitiu.
5. Lyzačné roztoky pred začatím práce zohriať na 50-60°C do rozpustenia usadeniny. Obsah skúmavky so sorbentom premiešať na vortexe do stavu homogénnej disperzie a do flakónu s lyzačným roztokom N2 pridať 80 μl suspenzie sorbentu. Veľmi dobre premiešať.
   Pozor! Lyzačný roztok N2 po otvorení a pridaní suspenzie sorbentu nepodlieha skladovaniu.
6. Odobrať a označiť potrebné množstvo skúmaviek s objemom 2 ml (podľa množstva analyzovaných vzoriek vrátane PKV a NKV).
7. Do každej skúmavky pridať po 30 µl roztoku VKV.
8. Pre negatívnu kontrolu do skúmavky (označenej NKV) pridať 100 μl NKV.
9. Pre pozitívnu kontrolu do skúmavky (označenej PKV) pridať 970 µl NKV a 30 µl PKV.
10. Do ostatných skúmaviek pipetou so samostatnými špičkami pridať po 1 ml analyzovanej vzorky v súlade s označením skúmaviek.
11. Do každej skúmavky bez dotyku steny skúmavky pridať po 1 ml koncentračného roztoku.
12. Skúmavky uzatvoriť vrchnákmi a obsah dôkladne premiešať otáčaním 5 krát a nechať 10-15 min. pri izbovej teplote. Následne centrifugovať 5 min. pri 3 000 ot/min. pri izbovej teplote.
13. Z každej skúmavky pipetou alebo vývevou so samostatnou špičkou odobrať supernatant.
14. Do každej skúmavky pridať po 200 μl lyzačného roztoku N1. Premiešať obsah skúmaviek vortexovaním počas 10-15 sek. do oddelenia sedimentu od dna skúmavky. Nechať pri izbovej teplote 5 minút a krátko centrifugovať pre odstránenie kvapiek zo stien skúmaviek.
15. Do každej skúmavky s lyzačným roztokom N1 pridať po 500 μl lyzačného roztoku N2 so sorbentom. Premiešať obsah skúmaviek vortexovaním počas 10-15 sek. Skúmavky inkubujte v termošejkri pri teplote 65 °C a 1 300 ot/min. Krátko centrifugovať pre odstránenie kvapiek zo stien skúmaviek.
16. Do každej skúmavky s analyzovanými vzorkami pridať po 750 μl zrážadla NK.
17. Vortexovať obsah skúmaviek 10-15 sek. Inkubovať pri izbovej teplote 3-5 min., centrifugovať 5 minút pri 13000 ot/min. (izbová teplota).
18. Opatrne bez porušenia sedimentu vložiť skúmavky do magnetického podstavca. Z každej skúmavky pipetou (alebo vývevou) so samostatnou špičkou odobrať supernatant, bez dotyku sedimentu.
19. Do každej skúmavky k sedimentu pridať 500 µl premývacieho roztoku N1. Premiešať obsah skúmaviek vortexovaním počas 10-15 sekúnd. Centrifugovať 2 min. pri 13000 ot./min.
20. Opatrne bez porušenia sedimentu vložiť skúmavky do magnetického podstavca. Z každej skúmavky pipetou (alebo vývevou) so samostatnou špičkou odobrať supernatant, bez dotyku sedimentu.
21. Do každej skúmavky k sedimentu pridať po 300 µl premývacieho roztoku N2. Premiešať obsah skúmaviek vo vortexe počas 10-15 sekúnd. Centrifugovať 5 min. pri 13 000 ot./min. (izbová teplota).
22. Opatrne bez porušenia sedimentu vložiť skúmavky do magnetického podstavca. Z každej skúmavky pipetou (alebo vývevou) so samostatnou špičkou odobrať supernatant, bez dotyku sedimentu.
23. Sušiť sediment v otvorených skúmavkách počas 2-3 min. pri izbovej teplote (18-25)°С.
24. Do každej skúmavky k sedimentu pridať po 200 µl eluačného roztoku. Dôkladne resuspendovať sediment vortexovaním. Inkubovať v termošejkri počas 10 min. pri 56 °C s frekvenciou otáčania 1 300 оt./min. Centrifugovať 1 min. pri 13 000 оt./min. Vzorky sú pripravené na realizáciu analýzy RT PCR.
    Pozor! Izolovaná DNA sa môže skladovať pri teplote 2-8°C nie dlhšie ako 24 hod.

Pri malom objeme skúmanej krvnej plazmy, je možné použiť na izoláciu DNA/RNA
500 µl analyzovanej vzorky.

V tomto prípade:

• Do skúmavky pridajte po 30 µl roztoku VKV.
• Pridajte 500 µl analyzovanej vzorky.
• Pridajte 500 µl koncentračného roztoku.
• ... ďalej postupovať od bodu 12.