Realbest extrakcia 100

Princíp činnosti sady „RealBest extrakcia 100“ je založený na teplotnom spracovaní vzorky lyzačným roztokom, ktorý rozruší komplex nukleových kyselín s bielkovinami, následnou sedimentáciou DNA na magnetické častice, premývaním etanolom a elúciou.

1. Pred začatím práce je potrebné vybrať sadu reagencii z chladničky, otvoriť obal a nechať spolu s analyzovanými vzorkami pri izbovej teplote 18-25°C asi 30 min.
2. Vybrať zo sady pre PCR „RealBest“ flakón s PKV, ktorá zodpovedá danej PCR sade.
3. Do flakónu s vnútornou kontrolnou vzorkou (VKV) pridať 1 ml roztoku pre obnovu kontrolných vzoriek (RKO) a dobre premiešať. Nechať pri izbovej teplote 15 min. a opäť dobre premiešať.
   Uskladnenie: po rozpustení skladovať pri teplote 2-8°C nie dlhšie ako 1 mesiac. NKV je pripravená k použitiu.
   Uskladnenie: po otvorení flakónu skladovať pri teplote 2-8°C nie dlhšie ako 1 mesiac.
4. Lyzačný roztok pred začatím práce zohriať na 50-60°C do rozpustenia usadeniny. Obsah skúmavky so sorbentom premiešať na vortexe do stavu homogénnej disperzie a do flakónu s lyzačným roztokom pridať 260 μl suspenzie sorbentu. Veľmi dobre premiešať.
   Pozor! Lyzačný roztok po otvorení a pridaní suspenzie sorbentu nepodlieha skladovaniu.
5. Odobrať a označiť potrebné množstvo skúmaviek s objemom 2 ml (podľa množstva analyzovaných vzoriek vrátane PKV a NKV).
6. Do každej skúmavky pridať po 30 µl roztoku VKV.
7. Pre negatívnu kontrolu do skúmavky (označenej NKV) pridať 100 μl NKV.
8. Pre pozitívnu kontrolu do skúmavky (označenej PKV) pridať 80 µl NKV a 20 µl PKV.
9. Do ostatných skúmaviek pipetou so samostatnými špičkami pridať po 100 μl analyzovaných vzoriek v súlade s označením skúmaviek.
10. Do každej skúmavky pridať po 300 μl lyzačného roztoku so sorbentom. Premiešať obsah skúmaviek vortexovaním počas 10-15 sek. Nechať skúmavky v termošejkri pri teplote 65°C a 1300 ot/min. počas 5 min. Krátko centrifugovať pre odstránenie kvapiek zo stien skúmaviek.
    V prípade, že nedôjde k dostatočnej lýze, je potrebné preniesť obsah do čistej skúmavky bez dotyku usadeniny.
11. Do každej skúmavky s analyzovanými vzorkami pridať 400 μl zrážadla DNA.
12. Vortexovať obsah skúmaviek 10-15 sek. Centrifugovať pri 13000 ot/min pri izbovej teplote počas 5 min.
13. Opatrne bez porušenia sedimentu vložiť skúmavky do magnetického podstavca. Z každej skúmavky pipetou (alebo vývevou) so samostatnou špičkou odobrať supernatant, bez dotyku sedimentu.
14. Do každej skúmavky k sedimentu pridať 500 µl roztok na premytie č. 1. Premiešať obsah skúmaviek vo vortexe počas 10-15 sekúnd. Centrifugovať 2 min. pri 13000 ot./min.
15. Opatrne bez porušenia sedimentu vložiť skúmavky do magnetického podstavca. Z každej skúmavky pipetou (alebo vývevou) so samostatnou špičkou odobrať supernatant, bez dotyku sedimentu.
16. Do každej skúmavky k sedimentu pridať 300 µl roztok na premytie č. 2. Premiešať obsah skúmaviek vo vortexe počas 10-15 sekúnd. Centrifugovať 2 min. pri 13000 ot./min.
17. Opatrne bez porušenia sedimentu vložiť skúmavky do magnetického podstavca. Z každej skúmavky pipetou (alebo vývevou) so samostatnou špičkou odobrať supernatant, bez dotyku sedimentu.
18. Sušiť sediment v otvorených skúmavkách počas 2-3 min. pri izbovej teplote (18-25)°С.
19. Do každej skúmavky k sedimentu pridať po 600 µl eluačného roztoku. Dôkladne resuspendovať sediment vo vortexe. Inkubovať v termošejkri počas 10 min. pri 56°C s frekvenciou otáčania 1300 оt./min. Centrifugovať 1 min. pri 13000 оt./min. Vzorky sú pripravené na realizáciu analýzy RT PCR.