Realbest extrakcia 1

Princíp činnosti tejto sady je založený na teplotnom spracovaní vzorky lyzačným roztokom, ktorý rozruší komplex nukleových kyselín s bielkovinami, následnou sedimentáciou DNA na magnetické častice, premývaním etanolom a elúciou. Pred začatím práce je potrebné vybrať sadu reagencii z chladničky, otvoriť obal a nechať spolu s analyzovanými vzorkami pri izbovej teplote 18-25°C asi 30 min. Zo sady pre „RealBest“ PCR série vybrať flakón s univerzálnou pozitívnou vzorkou (PKV).

1. Lyzačný roztok s VKV je potrebné pred začatím práce zohriať na 50-60°C do rozpustenia sedimentu, a premiešať.
2. Príprava analyzovaných vzoriek. Krátkou centrifugáciou odstrániť kvapky zo stien skúmaviek s prepravným roztokom obsahujúcim analyzovaný materiál. Moč preniesť do 10 ml centrifugačnej skúmavky. Centrifugovať počas 5 min pri 3000 ot/min. Odstrániť supernatant tak, aby v skúmavke zostal objem supernatantu nad usadeninou 0,5 až 1 ml. V prípade zvýšeného obsahu soľného sedimentu je nutné premyť sediment 1 ml fyziologického roztoku.
3. Spracovanie klinických vzoriek (izolácia DNA). Vybrať a označiť potrebné množstvo skúmaviek s objemom 2 ml (podľa množstva analyzovaných vzoriek vrátane PKV a NKV).
4. Vortexovaním premiešať obsah flakónu sorbentu a pridať 200 µl do flakónu s lyzačným roztokom.
5. Do každej skúmavky pridať po 500 μl lyzačného roztoku s VKV a sorbentom.
6. Do skúmaviek s obsahom lýzačného roztoku (VKV a sorbent) pridať po 100 µl vzorky* pomocou špičiek s filtrom. *Pred vložením vzorky opakovaným pipetovaním (alebo premiešaním vortexom) resuspendovať sediment buniek, ktorý sa vytvoril v skúmavke s prepravným roztokom po centrifugácií, aby sa do izolácie dostala suspenzia buniek.
7. Pre pozitívnu kontrolu do skúmavky (označenej PKV) pridať 100 µl PKV.
8. Pre negatívnu kontrolu do skúmavky (označenej NKV) pridať 100 μl NKV.
9. Všetky skúmavky pevne uzavrieť a dobre premiešať ich obsah na vortexe 10 sek.
10. Vložiť skúmavky do vopred vyhriateho termostatu na 75°С a inkubovať 15 minút.
11. Krátkou centrifugáciou odstrániť kvapky zo stien skúmaviek.
12. Do každej skúmavky s analyzovanými vzorkami pridať 600 μl zrážadla DNA.
13. Vortexovať obsah skúmaviek 10-15 sek.
14. Nechať pri izbovej teplote 3-5 min. a centrifugovať pri 13000 ot/min počas 3 min.
15. Opatrne bez porušenia sedimentu vložiť skúmavky do magnetického podstavca. Z každej skúmavky pipetou (alebo vývevou) so samostatnou špičkou odobrať supernatant, bez dotyku sedimentu.
16. Do každej skúmavky k sedimentu pridať 800 µl roztok na premytie. Premiešať obsah skúmaviek vo vortexe počas 10-15 sekúnd. Centrifugovať 3 min. pri 13000 ot./min.
17. Opatrne bez porušenia sedimentu vložiť skúmavky do magnetického podstavca. Z každej skúmavky pipetou (alebo vývevou) so samostatnou špičkou odobrať supernatant, bez dotyku sedimentu.
18. Sušiť sediment v otvorených skúmavkách počas 1-2 min. pri izbovej teplote (18-25)°С.
19. Do každej skúmavky k sedimentu pridať po 600 µl eluačného roztoku.
20. Dôkladne premiešať obsah skúmaviek vo vortexe 10-15 sek.
21. Inkubovať v termošejkri počas 10 min. pri 75°C s frekvenciou otáčania 1300 оt./min. Centrifugovať 1 min. pri 13000 оt./min. Vzorky sú pripravené na realizáciu analýzy RealTime PCR. Pozor! Izolovaná DNA sa môže skladovať pri teplote 2 až 8°C počas jedného týždňa.