Kolónková izolácia

Kolonková izolácia DNA je vysokorýchlostná a efektívna metóda izolácie DNA. Doporučuje sa na izoláciu DNA z rôznych biologických vzoriek s vysokým obsahom DNA.

1. Príprava pracovného roztoku Soľného pufru. Obsah flakónu, 10 ml 10-násobného Soľného pufru zmiešať s 200 ml 70% etanolu a premiešať. Hotový pracovný roztok Soľného pufru treba skladovať v hermeticky uzatvorenej nádobe pri teplote 2-8 °C počas jedného roka.
2. Rozmiestniť potrebný počet mikrokolóniek spolu so zásobníkovými mikroskúmavkami do stojanu.
3. Do 1,5 ml mikroskúmavky so 100 l analyzovanej vzorky (krv, sérum, plazma, ster zo sliznice v roztoku, moč...) pridať 300 l lyzačnej reagencie a premiešať prevracaním mikroskúmavky.
4. Pri výskyte nesolubilného materiálu treba dať mikroskúmavku do termostatu na 5 min. pri 65 °C a potom centrifugovať 5 až 10 sekúnd pri 5 000 ot/min. Priezračný supernatant použiť pre izoláciu DNA a sediment odhodiť.
5. Pridať obsah mikroskúmavky (supernatant) do mikrokolónky a centrifugovať ju spolu so zásobnou mikroskúmavkou pri 3 000 ot/min. počas 3 minút. (V prípade, že izolácia DNA sa robí z plnej krvi alebo z homogenátov tkanív s vysokým obsahom hemoglobínu, je potrebné dodatočne premyť mikrokolónku 300 l lyzačnej reagencie). Filtrát vyliať.
6. Pridať do mikrokolónky 750 μl Soľného pufru (pozri bod 1.) a centrifugovať 1 min. pri 10 000 ot/min. Filtrát vyliať.
7. Opakovať bod 6.
8. Pridať do mikroskúmavky 500 μl Soľného pufru (pozri bod 1.) a centrifugovať 1 min. pri 10 000 ot/min. Filtrát vyliať.
9. Ďalej centrifugovať mikrokolónky 3 min. pri maximálnych otáčkach (14 000 ot/min). Kolónky nemôžu obsahovať zostatky etanolu. Sušiť mikrokolónky 3-5 min. pri 65°C.
10. Pridať do mikrokolónky na membránu 50-100 l ExtraGenu TETM.
11. Preniesť mikrokolónku do čistej mikroskúmavky.
12. Centrifugovať mikrokolónku s mikroskúmavkou 1 min. pri maximálnych otáčkach (14 000 ot/min.)
13. Filtrát, ktorý obsahuje DNA použiť pre analýzu. Uskladniť pri teplote mínus 20 °C.